Immunophénotype des leucémies aiguës myéloïdes

Immunophénotypage : outil majeur dans la démarche diagnostique des LA, en complément de l'analyse cytologique, notamment grâce à sa rapidité et son accessibilité.

 

-          Il permet de déterminer l'appartenance à une lignée cellulaire précise, et de préciser le niveau de différenciation pour identifier et/ou préciser le diagnostic des diverses formes de LA (classification WHO 2008 des LA).

 

-          peut avoir un rôle pronostique par la mise en évidence d'un phénotype corrélé à des anomalies cytogénétiques et/ou moléculaires

 

-          permet d'identifier la présence de certains marqueurs au sein des blastes en vue d'une utilisation d'une thérapeutique ciblée par anticorps monoclonaux

 

-          permet de détecter le profil antigénique aberrant des blastes pouvant se révéler utile pour suivre la maladie résiduelle.

 

1 - Principe d'analyse des blastes en cytométrie de flux

 

Méthode définie par le Groupe de Travail sur les Leucémies et Lymphomes en Francophonie et le Groupe d'Étude Immunologique des Leucémies (1)

 

Échantillon : moelle osseuse ou sang (prélevés sur tube EDTA).

On travaille soit sur des cellules nucléées isolées (gradient de densité sur ficoll) soit sur sang ou moelle totale (puis lyse des GR). Les suspensions de cellules sont mises en contact avec des solutions d’anticorps (Ac) couplés à divers fluorochromes. L'utilisation combinée d’Ac couplés à différents fluorochromes (4 couleurs) permet de séparer les différentes populations cellulaires en cinq clusters après analyse par les faisceaux lasers du cytomètre de flux. Une couleur spécifique est attribuée à chaque cluster.

 

Le scattergram FSC/SSC permet d'éliminer les débris cellulaires.

 

Le scattergram CD45/SSC constitue le masque de référence définissant les régions (fenêtres ou gates) d'analyse. On peut y superposer l'expression de marqueur de maturité spécifique de lignée afin de recadrer les fenêtres sur les populations d'intérêt.

 

L'aire "Bermudes" comprend les cellules hématopoïétiques immatures et la population blastique de la majorité des LA.

 

CMFA

 

Une fois la population d'intérêt identifiée, on détermine le profil d'expression de divers antigènes à la surface ou dans le cytoplasme des blastes : on superpose au scattergram CD45/SSC les cellules exprimant un ou une combinaison d'antigène (= backgating).

 

2 - Démarche pratique et immunophénotype des Leucémies Aiguës.

 

2.1. Assignation de lignée des blastes et définition des entités cliniques (étape commune aux LAM et LAL) : panel obligatoire

 

Cette étape permet également d'établir un diagnostic différentiel entre les LA, les lymphomes, les tumeurs non-hématopoïétiques et les états réactionnels.

 

On utilise un panel d'anticorps constitué des marqueurs les plus spécifiques de chaque lignée hématopoïétique et de marqueurs d'immaturité ou de maturation.

 

Au moins 2 Ag de lignée doivent être exprimés par les blastes pour confirmer leur appartenance à une lignée. Les LA indifférenciées n'expriment aucun marqueur spécifique de lignée lymphoïde ou myéloïde mais sont CD34+/CD45low.

 

Le CD45 qui permet de réaliser les fenêtrages est un Ag de maturité et un marqueur pan leucocytaire.

 

Orientation rapide

(assignation de lignée)

 

Définition d'entités cliniques

Ag d'immaturité

 

 

CD34

TdT

 

 

HLA-DR

Ag de lignée précoces

Myéloïde

 

MPO CD13 CD33

 

Lymphoïde

 

 

T

 

 

cCD3 CD2 CD7

CD1a CD5

 

B

cCD79a

CD10 CD19 CD22 s ou c

 

Ag de lignée plus tardifs

Ag pan-leucocytaire

 

 

CD45

 

Myéloïde

 

 

 

 

CD14 CD65

CD41 ou CD61

CD235 ou CD36

 

Lymphoïde

 

T

 

 

CD4 CD8 sCD3

B

 

sIg

 

Autres lignées (NK, pDC…)

 

 

CD56

 

pDC : cellules dendritiques plasmocytoïdes

 

En rouge = marqueurs localisés au niveau cytoplasmique ou nucléaire ; le marquage nécessite des agents de perméabilisation cellulaire (TdT : marquer lymphoïde et des LAM peu différenciées).

 

Remarque : CD2, CD56, CD7, et CD19 sont des Ag lymphoïdes fréquemment exprimés dans les LAM et sont donc moins fiables pour l'assignation de lignée.

 

2.2. Panel additionnel aidant au diagnostic des LA

 

Lymphoïde

T

 

 

TCR

 

B

 

Chaînes légères intra-cytoplasmiques ou membranaires

CD9 PAX5

 

 

 

NK

 

CD7 CD16 CD56 CD57 CD94 CD158

 

 

Myéloïde

Contenu enzymatique des myéloblastes

 

 

 

 

Précoce : MPO CD133

Différencié : lactoferrine intra-cytoplasmique

 

 

 

Neutrophile

CD15 CD16 CD11b

(CD10+)

 

 

 

Monocytaire

CD4low CD11b CD14 CD36 CD64

La co-expression des Ag est importante

Lyzozyme positif

 

 

 

Érythroïde

 

CD36 CD71 CD235

 

 

 

Plaquettaire

 

CD41 CD42 CD61

 

 

 

pDC

CD4 CD56 CD123 CD68 BDCA

Lyzozyme négatif

 

 

2.3. Diagnostic immunophénotypique des LAM

 

La classification actuelle des LAM (OMS 2008) est fondée sur l'identification des anomalies cytogénétiques.

 

L'immunophénotypage reste cependant indispensable pour le diagnostic des LAM0 et LAM7.

 

Il confirme le diagnostic des LAM1. Il est moins indispensable pour la LAM3 (hormis LAM3 var) ou les LAM2, LAM4, LAM5 et LAM6.

 

LAM

Ag myéloïdes communs

Ag spécifiques de lignée

Ag aberrants

Particularités

Lymphoïdes

Altérations de l'expression

 

LAM0

 

CD34 HLA-DR CD13 CD33

 

 

TdT

MPO-

 

LAM1

 

CD34 HLA-DR  MPO CD13 CD33 CD65

 

CD117

     

LAM2 avec t(8;21)

 

CD34 HLA-DR  MPO CD65

 

CD19low

CD56

 

 

CD13low CD33low

 

LAM2 sans t(8;21)

 

CD2+ ou CD7+

(CD19-)

 

 

CD13high CD33high

 

LAM3 = APL t(15;17)

MPO CD13 CD33 CD65

CD117

CD2+/-

CD34- HLA-DR- CD15-

CD11a- CD18-

CD11b- CD11c-

 

 

 

LAM3 var

 

CD2+

CD9 inconstant

 

 

 

CD34+

LAM4

CD34 HLA-DR  MPO CD13 CD33 CD65

CD4 CD14 CD11b CD11c CD45

CD19high

 

Il est difficile de différencier les monocytes normaux des cellules leucémiques

 

LAM4 éo

Inv16 (CBFb/MYH11)

 

 

 

CD2+

   

LAM5

HLA-DR MPO CD33 CD65

CD4 CD14* CD11b CD11c

CD15 CD36 CD64 lysozyme

 CD56+

CD34-

CD41low CD61low (adsorption plaquettaire sur les blastes)

 

 

 

LAM6

 

MPO CD13 CD33 si composante myéloïde

 

 

CD36 CD235 CD71

     

LAM7

 

CD34 HLA-DR CD13 CD33

 

 

CD41 CD61 CD42b CD4 CD36 CD45

 

     

Leucémie à précurseurs basophiles et mastocytes

 

CD13 CD33

 

CD22+

CD9 CD25

 

 

 

Rechercher un chromosome j ou le transcrit BCR-ABL

Leucémie à précurseurs DC

 

 

MPO- TdT variable HLA-DR+ CD33 variable

CD4 CD56 CD123 BDCA

CD68 variable

CD22+

 

lin- lysozyme-

Pas de mq B et T

 

* CD14 : parfois négatif chez l'enfant

 

Lien avec les réarrangements géniques mis en évidence par biologie moléculaire :

            réarrangement du gène MLL (maintenant KMT2A) : expression du marqueur 7.1.

            mutation FLT3-IDT : CD34- HLA-DR- CD56+ CD123+ CD133-

            mutation NPM1 : CD34-

            mutation CEBPA : CD7+

 

Remarque : La mastocytose systémique, intégrée dans les syndromes myéloprolifératifs, dissémine parfois dans le sang. Les mastocytes malins expriment des Ag aberrants CD2+ et CD25+, et présentent une altération de l'expression du CD117 : CD117dim .

 

3.  Suivi de la réponse au traitement et suivi de la maladie résiduelle (MRD : Minimal Residual Disease)

 

Les blastes des LA expriment un profil phénotypique différent des cellules normales en cours de maturation :

            - expression aberrante de marqueurs d'autres lignées,

            - asynchronisme d'expression de marqueurs d'immaturité et de maturité,

            - diminution ou absence d'expression de marqueurs normalement présents au stade de maturation des cellules de la lignée dont est issue la cellule leucémique,

            -  sur-expression d'un marqueur).

 

Seuil de sensibilité de la technique cytométrique : 1.10-4

 

La cytométrie présente l'avantage par rapport à la biologie moléculaire de faire la distinction entre les cellules viables et les cellules mortes.

 

LAL

La cytométrie vient en complément de la biologie moléculaire pour suivre la réponse au traitement. La rémission phénotypique se définit à J35 et à J70 par un taux de blastes détectés < 1 % et < 0,1 %, respectivement.

 

Elle permet également de quantifier la MRD et de prédire ainsi le risque de rechute.

Ag utilisés :

-          LAL-T : CD99

-          LAL-B : CD58, CD123

 

LAM

 

La détection de la MRD dans les LAM est moins bien établie que pour les LAL.

 

Limites de la technique dans le suivi de la MRD :

 

-          nombre d'événements importants à acquérir pour augmenter la sensibilité

-          la limite de détection dépend du nombre de cellules analysées, de la présence d'un éventuel contaminant, du bruit de fond

-          changement du phénotype des blastes avec le temps et les traitements

 

 

 

Références

(1) Arnoulet C., Béné MC. et al : Four- and five- color flow cytometry analysis of leukocyte differentitayion pathways in normal bone marrow : a reference document based on a systematic approach by the GTLLF and GEIL. Clinical Cytometry, 2010;78B:3-10

(2) Craig F. E, Foon K. A. : Flow cytometric immunophenotyping for hematogic neoplasms. Blood 2008;vol111,8

(3) Béné MC, Nebe T. et al : Immunophenotyping of acute leukaemia and lymphoproloferative disorders : a concensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia 2011;25,567-574.

 

 

 

Document rédigé par Camille Ramirez, Interne en Biologie (septembre 2011)