La granulopoïèse neutrophile

 Les granulocytes neutrophiles matures sont des cellules contenant de nombreuses granulations brun-rouge dans le cytoplasme et un noyau segmenté en plusieurs lobes : on les appelle pour cela « polynucléaires neutrophiles » (PNN).

 

Ces PNN sont le point final de la différenciation au sein de la moelle osseuse (MO) de progéniteurs (pluripotents puis spécialisés) puis de précurseurs de la lignée neutrophile. Ces PNN matures migrent dans le sang périphérique avant de sortir des vaisseaux sanguins pour se localiser dans les tissus où ils vont exercer leurs fonctions, dont la principale est la lutte antibactérienne par phagocytose puis bactéricidie. Les PNN meurent dans les tissus en 1 à 3 jours.

 

La MO produit 50 milliards de PNN chaque jour. En cas de besoin accru en PNN il existe des compartiments de stockage ou de réserve, mobilisables en quelques minutes, puis, si nécessaire, la production médullaire peut augmenter, régulée par des cytokines (facteurs de croissance hématopoïétiques) et leurs récepteurs à la surface des progéniteurs et précurseurs.

 

 

1. Les progéniteurs

- Essentiellement intramédullaires : leur nombre total est très faible (< 0.1% des cellules de la MO).

- On peut les isoler par des techniques de tri immunomagnétique [cellules de 15-20 µm de diamètre, avec un grand noyau arrondi et très peu de cytoplasme (= morphologie commune aux divers progéniteurs hématopoïétiques)];

- On peut les m.e.e. indirectement par culture in vitro.

 

Progéniteur précoce = CFU-GM (Colony Forming Unit Granulocytaire Monocytaire).

Il provient de la différenciation des CFU-GEMM, sous l’influence de diverses cytokines : SCF, FLT3L, GM-CSF, IL-3 (les 2 dernières agissent sur la prolifération / amplification),

 M-CSF et G-CSF agissent sur la différenciation respectivement en CFU-M ou CFU-G.

La CFU-GM produit après culture in vitro des colonies (mixtes, de grande taille) en 14-21 j

Phénotype : HLA-Dr+, CD34+, CD45 RA+, CD117 +, MPO -

 

Progéniteur tardif = CFU-G.

Donne après culture in vitro  des colonies (monolignée, plus petites) en 7 J.

C’est un progéniteur spécialisé (perte de la pluripotence).

Phénoptype : CD34+, HLA-Dr+, CD45 RA+, CD33+, CD117+, MPO +/-.

Se différencie en myéloblastes en présence de G-CSF.

 

2. Les précurseurs neutrophiles.

Caractérisés par la présence de granulations, +/- visibles après coloration standard (MGG), et apparaissant progressivement au cours de la maturation de la lignée.

 

Le premier précurseur neutrophile définissable morphologiquement (càd au microscope optique classique) est le myéloblaste, qui se divise successivement en promyélocytes, en myélocytes, puis en métamyélocytes.  Les métamyélocytes ne se divisent pas : c’est à ce stade que le noyau se segmente en lobes pour produire les PNN.

 

Au cours de ces étapes la chromatine se condense progressivement alors que dans le cytoplasme la basophilie disparaît progressivement (diminution de la quantité d’ARN) et que des granulations apparaissent en grand nombre.

 

Chez le sujet sain, les divers précurseurs s’observent uniquement dans la MO ; ils représentent globalement 50 – 70 % du total des cellules médullaires (voir résultat du myélogramme normal).

 

Myéloblaste.

Grande taille : 20 – 25 µm de diamètre, arrondi ou ovalaire.

Rapport N/C (= volume du noyau / volume de la cellule): environ 0.8.

Noyau : volumineux, arrondi ou ovalaire ; chromatine fine (= claire = euchromatine) ; 1 – 3 nucléoles.

Cytoplasme : taille réduite, basophile (couleur bleue liée à l’ARN), avec quelques granulations primaires rouges (=azurophiles), correspondant à des lysosomes.

Contour externe de la cellule : régulier (idem pour l’ensemble des précurseurs granulocytaires).

Remarque : dans les pays anglo-saxons le myéloblaste ne contient pas de granulations : l’apparition de quelques granulations rouges caractérise le début du stade promyélocyte (« early promyelocyte »).

 

Promyélocyte.

Provient de la division des myéloblastes.

C’est le stade au cours duquel les granulations primaires sont produites en grande quantité.

Taille variable (20 – 30 µm de diamètre), avec rapport N/C = 0.6-0.7.

Noyau ovalaire : la condensation chromatinienne est faible, et il persiste souvent un nucléole.

Cytoplasme : au moins une partie est encore nettement basophile. Présence de très nombreuses granulations azurophiles, souvent dispersées dans tout le cytoplasme et posées sur le noyau : elles semblent parfois provenir d’une zone claire cytoplasmique proche du noyau (= archoplasme = appareil de Golgi (non coloré) qui produit les granulations].

 

Myélocyte.

Provient de la division des promyélocytes.

A ce stade la production de granulations primaires cesse et celle des granulations secondaires ou « spécifiques » est maximale.

Taille : 20 – 25 µm de diamètre, avec rapport N/C = 0.5 – 0.6.

Noyau arrondi ou ovalaire, ou avec une face aplatie vers le cytoplasme : chromatine dense (la texture se rapproche de celle du PNN) ; il n’y a plus de nucléole.

Cytoplasme : il a perdu sa basophilie et sa couleur se rapproche de celle du PNN ; il contient de nombreuses granulations, mélange de granulations primaires et de granulations secondaires « spécifiques », plus petites et de couleur brune ou brun-lilas.

 

Métamyélocyte.

A la suite de 3 divisions, les myélocytes se transforment en métamyélocytes : la majorité des synthèses protéiques cesse.

Taille proche de celle du PNN (15 - 18 µm de diamètre), avec rapport N/C = 0.3 – 0.4.

Noyau incurvé ou allongé en fer à cheval ou en saucisse ; chromatine dense, proche de celle du PNN. Ce noyau allongé va subir un à trois pincements (strictions), pour donner naissance aux lobes nucléaires.

Cytoplasme : aspect comparable à celui du PNN, riche en granulations secondaires brunes (à ce stade les granulations primaires ne représentent plus que 20% du total des granulations, ne sont plus colorées par le MGG et ne sont donc plus visibles).

 

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3. Polynucléaires neutrophiles.

Issus de la segmentation du noyau du métamyélocyte (pas de division cellulaire).

Taille : 15 µm de diamètre en moyenne, avec rapport N/C = 0.3 – 0.4.

Cytoplasme : riche en granulations brunes sur un fond clair discrètement rosé.

Noyau : 2 à 5 lobes (majoritairement 3 ou 4) reliés entre eux par un fil de chromatine. La chromatine est densément mottée.

Le nombre de lobes est déterminé pour un PNN donné, et ne correspond pas réellement à un niveau de maturité ou d’immaturité. Il n’y a pas d’explication fonctionnelle quant à l’utilité de la lobulation nucléaire.

 

Remarques.

Dans divers pays on définit des « band cells » ou PNN juvéniles = étape intermédiaire entre métamyélocyte et polynucléaire. Dans un « polynucléaire » l’épaisseur du pont chromatinien est inférieure à 2/3 de l’épaisseur du noyau ou que ce sont des fils de chromatine qui relient les lobes nucléaires ; dans les autres cas c’est une « band cell ».

Parfois il est également défini une « stab cell », intermédiaire entre band cell et PNN.

 

4. Caractéristiques de la granulopoïèse neutrophile

 

4.1. Les quatre types de granulations.

 

* Granulations primaires ou azurophiles

Nettement visibles dans le cytoplasme des myéloblastes et promyélocytes : colorées en rouge par le colorant azur de méthylène contenu dans le MGG (=lysosomes).

Produites en majorité au stade promyélocyte.

Constituent environ 20% du total des granulations du PNN mature (peu visibles à ce stade, car peu colorées).

Fonction principale : antimicrobienne, par fusion puis déversement de leur contenu dans les vacuoles de phagocytose (= phago-lysosomes).

Principaux constituants :

Myéloperoxydase (MPO) : enzyme qui produit de l’hypochlorite (ClO-) à partir du perhydrol généré par le stress oxydatif ;

Protéines cationiques antimicrobiennes (contre : bactéries, virus, champignons) ou défensines (Human Neutrophil Defensins ou HNP-1 à HNP-3) ;

De nombreux autres composants : élastase, lysozyme (dégrade les parois bactériennes), azurocidine (action particulière contre C. albicans), …

La membrane porte les antigènes CD66c, CD63, CD68.

 

*  Granulations secondaires ou spécifiques

Nettement visibles et majoritaires aux stades myélocyte, métamyélocyte et PNN mature ; couleur brun foncé (+/- rouge ou « lilas »).

Produites principalement au stade myélocyte.

Dans le PNN elles constituent la majorité (60-80%) des granulations.

Fonction principale: libération de leur contenu dans le milieu extérieur (et les vacuoles de phagocytose).

Principaux constituants :

Apolactoferrine: protéine à activité antibactérienne par liaison au fer (nécessaire à la croissance bactérienne);

Collagénase: dégradation du collagène (pour la migration) et participation au remodelage tissulaire (cicatrisation) ;

Autres: lysozyme, activateur du plasminogène, Vitamine B12-binding protein, …

Fonctions principales : action antibactérienne, modulation de l’inflammation, participation à la chimiotaxie et la migration cellulaire (le déficit constitutionnel en granules spécifiques provoque un défaut de chimiotaxie et d’adhésion des PNN, avec infections cutanées et respiratoires à répétition).

Sur la membrane des granulations secondaires on retrouve diverses molécules également présentes sur la membrane cellulaire externe (récepteurs de molécules d’adhésion notamment).

 

*  Granulations tertiaires

Ou granulations contenant de la gélatinase.

Apparaissent au stade métamyélocyte. On ne les voit pas en microscopie optique

Rôle : aider à la migration tissulaire.

 

*  Vésicules sécrétoires

Petites vésicules, non visibles au microscope optique

Formées par endocytose de la membrane externe du PNN, elles contiennent de l’albumine, de la phosphatase alcaline et des récepteurs FMLP, et portent en surface les récepteurs pour le complément CR1 (ou CD35) et CR3 (CD11b) : ce sont des sources de ces récepteurs, qui se redirigent rapidement vers la surface du PNN quand celui-ci est stimulé.

Elles apparaissent tardivement, aux stades métamyélocyte et polynucléaire mature.

Remarque.

La phosphatase alcaline leucocytaire est fortement exprimée au cours des infections, des polynucléoses réactionnelles et de la grossesse, et quasiment absente des PNN de la LMC (la recherche de cette enzyme par cytochimie était autrefois un critère de diagnostic de la LMC).

 

4.2. Les antigènes membranaires

 

Myéloblaste

CD34+     CD117+    CD13+  CD33+

Promyélocyte

CD34 -  CD117+/-  CD13+   CD33+    CD65+  CD15+/-

Myélocyte

                               CD13+  CD33+     CD65+ CD15+  CD11b+/-

Métamyélocyte

                             CD13+  CD33+/-  CD65+ CD15+  CD11b+   CD16+

PNN

                          CD13+ CD33+/-    CD65+ CD15+  CD11b+ CD16+ CD35+ CD10+

La myéloperoxydase est intracytoplasmique (granules primaires) : c’est le marqueur de toutes les cellules de la lignée neutrophile.

 

 

4.3. Aspects cinétiques

 

Deux compartiments intra-médullaires, 2 compartiments sanguins, 1 compartiment tissulaire

 

Dans la moelle osseuse : 2 compartiments

 

- Compartiment de prolifération (ou mitotique) : il comprend les myéloblastes, promyélocytes et myélocytes. On y observe plusieurs divisions cellulaires :

le myéloblaste (temps de transit ou durée de vie = 1 j) se divise en 2 promyélocytes (durée de vie = 1 à 2 j) qui se divisent en 4 myélocytes (durée de vie = 2 à 7 j), lesquels se divisent 2 ou 3 fois pour donner les métamyélocytes.

 

- Compartiment de maturation et de stockage : il comprend les métamyélocytes (durée de vie = 1 à 3 j) et les PNN (durée de vie = 1 à 8 j dans la MO) : ces cellules ne se divisent pas, mais leur maturation se poursuit (formation des granules spécifiques).

La quantité totale de PNN du compartiment de stockage médullaire est de 10 fois supérieure à celle du compartiment sanguin.

 

- Bilan

Un myéloblaste donne naissance à 16 - 32 PNN.

Une CFU-GM produit des PNN sanguins en 10-14 jours (= 2-3 j de plus que pour produire des monocytes sanguins).

Un myéloblaste donne naissance à des PNN sanguins en 7 jours.

Ces durées peuvent être raccourcies : diminution du Nb de mitoses diminution du temps de transit dans le compartiment mitotique, et/ou diminution du temps de transit dans le compartiment de maturation et de stockage (c’est-à-dire une libération plus rapide dans le sang). Le temps de réapparition des PNN dans le sang après aplasie (chimioinduite) ne peut cependant pas être inférieur à 4 – 5 jours (il sera optimisé par injection de G-CSF).

 

Dans les vaisseaux sanguins : deux compartiments

 

Les PNN de la MO traversent les interstices entre les cellules endothéliales des sinusoïdes médullaires et arrivent dans le sang.

Les mécanismes qui régulent ce passage vers le compartiment sanguin sont mal connus, mais sont influencés par diverses cytokines : tumor necrosis factor (TNF)-α, TNF-β, G-CSF, GM-CSF, IL-8 et C5a.

Environ 50% des PNN sanguins circulent dans les vaisseaux (= pool circulant) et 50% sont collés aux parois (= pool marginé) : il y a équilibre permanent entre ces 2 compartiments.

 

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La durée de vie d’un PNN est de 12H dans le pool circulant et de 12H dans le pool marginé.

 

La masse totale de PNN des compartiments marginé + circulant est 10 fois plus faible que celle du compartiment de stockage médullaire.

 

Dans les tissus : un seul compartiment

 

Schématiquement les PNN du sang circulant adhèrent aux parois vasculaires : ils « roulent » sur les parois, puis adhèrent plus fortement et s’étalent avant de sortir du vaisseau par passage entre les cellules endothéliales (= diapédèse).

Les PNN du pool tissulaire vont (ou non) exercer leur fonction antimicrobienne.

 

Leur durée de vie est de 1 à 3j dans les tissus : ils meurent après avoir exercé leur fonction, ou par un mécanisme de dégénérescence cytoplasmique ou par apoptose (avec fragmentation du noyau en masses violettes dispersées, et maintien de l’aspect du cytoplasme). Les débris des PNN sont phagocytés par les macrophages (ce qui explique que la mort des PNN ne s’associe pas de libération du contenu des granules dans les tissus).

L’apoptose est retardée dans diverses circonstances : grossesse, excès d’oestrogènes et de progestérone, de glucocorticoïdes, milieu hypoxique (vie + longue sur les sites d’inflammation).

 

Remarque : Chez un patient prélevé « à jeun » le nombre des leucocytes ne comprend que les PNN circulants ; chez un patient prélevé « non à jeun » ou stressé les PNN se démarginent et le nombre les leucocytes de la NFS inclut les PNN circulants + marginés. 

 

5. Régulation de la granulopoïèse

 

Elle se réalise à divers niveaux :

 

* Stimulation de la prolifération et de l’engagement des progéniteurs vers la lignée granulocytaire : avec divers facteurs de croissance dont les 2 principaux sont le GM-CSF, qui agit sur l’orientation myélo/monocytaire des progéniteurs, et le G-CSF, qui oriente les progéniteurs vers une différenciation en myéloblastes (ces 2 cytokines sont produites par génie génétique et utilisées en thérapeutique).

Remarque : Diverses cytokines produites par le microenvironnement (= cellules graisseuses, cellules épithéliales, et phagocytes mononucléés) peuvent induire l’entrée des progéniteurs dans le cycle cellulaire = prolifération pour un  autorenouvellement et/ou une différenciation.

 

* Stimulation du recrutement des neutrophiles matures du pool de stockage médullaire : libération accrue dans le sang provoquée par l’endotoxine bactérienne, les G- et GM-CSF, TNF alpha et bêta, IL-8, …),

 

* Stimulation de la fonction neutrophile : activation des mécanismes de phagocytose/bactéricidie par diverses cytokines (G-CSF, TNF-α, IL-6, IL-1, et IL-8).

Stimulés par les lipopolysaccharides les neutrophiles peuvent produire diverses cytokines : IL-1, TNF-α, …

 

* Inhibiteurs de la granulopoïèse

Lactoferrine. Présente dans les granulations secondaires, elle se lie partiellement à des récepteurs spécifiques sur les macrophages et induit une diminution de production de certaines cytokines, dont le GM-CSF.

Transferrine.  Inhibe la production de GM-CSF par les lymphocytes T.

 

Aspects moléculaires

Bien définis chez la souris, en partie applicables chez l’homme.

L’expression du facteur de transcription C/EBP alpha dans le progéniteur commun lymphoïde myéloïde permet une différenciation en progéniteur granulocytaire-monocytaire (GMP) ;

[protéine C/EBP alpha = CCAAT / Enhancer-Binding Protein Apha]

Ensuite :

                si l'expression de PU.1 est forte, le GMP se différencie en CFU-M (Monocytaire),

                si l’expression de C/GBP alpha et PU-1 sont faibles, le GMP se différencie en CFU-G (Granulocytaire).

 

6. Exploration de la granulopoïèse

 

L’hémogramme

Permet avec un automate d’hémogramme de déterminer le nombre de PNN du sang périphérique : 1.5 – 7 G/L chez l’adulte prélevé à jeun.

Le frottis sanguin coloré au MGG permet l’étude de la morphologie des PNN.

Chez le pt on à jeun ou stressé, ou après injection de noradrénaline (test de démargination) : les PNN se démarginent et leur nombre double à l’hémogramme (on compte les PNN circulants + démarginés).

 

Le myélogramme

Permet l’étude morphologique des diverses étapes de la granulopoïèse.

La ponction aspiration de la MO permet de réaliser des étalements ou frottis du suc médullaire, qui seront colorés (MGG) et permettront l’étude morphologique et la réalisation du myélogramme (= décompte en % des diverses cellules observées).

Sujet normal : les cellules de la granulopoïèse neutrophile représentent 50 – 70 % du total des cellules de la MO.

 

La ponction biopsie de MO permet d’obtenir une « carotte » d’os spongieux, que l’on va étudier par des méthodes histologiques (fixation, inclusion en paraffine, coupes histologiques colorées ensuite avec divers protocoles).

 

La culture in vitro des progéniteurs

Réalisable sur divers supports (agarose, collagène), elle permet une étude quantitative et qualitative des progéniteurs.

 

La cytométrie de flux.

Peut mettre en évidence l’absence ou l’expression anormale d’un ou plusieurs antigènes (usage dans le cadre des myélodysplasies).

 

La microscopie électronique : laboratoires spécialisés.

 

Fonctions des neutrophiles : voir physiologie des granulocytes neutrophiles.

 

sept 2011

 

 

 

Divers.

L’injection de G-CSF provoque :

     Expansion du pool mitotique,

     Diminution du temps de transit dans le compartiment post mitotique,

     Augmente les effets antibactériens des PNN (augmentation de l’expression de récepteurs (CD11b), augmentation de l’affinité du CD62-L pour son ligand (adhésion accrue), réactivité accrue au burst respiratoire),

     Modifie la morphologie des PNN matures (augmentation de la colorabilité des granulations = granulations + visibles),

     Ne modifie pas la durée de vie des PNN.

     De nombreuses cytokines peuvent elles-aussi activer les PNN